X-PDF

Вирусные гемагглютины, структура и функции. РГА (реакция гемагглюцинации) и РГадс (реакция гемадсорбции). Торможение этих реакций. Практическое использование.

Поделиться статьей

АГ вирусов. По структуре они тримеры (из 3 мономеров), каждый мономер состоит из 2 цепей: легкой и тяжелой. Одним участком легкая часть погружена в липидный суперкапсид, а другой участок дисульфидными связями соединена с тяжелым участком. Наружный участок тяжелой цепи – эпитоп (специфичность) и этим же участком прикрепляет вирус к сиаловым рецепторам дыхательных путей.У легкой части есть участок, обеспечивающий слияние суперкапсида с мембраной клетки.У легкой цепи есть участок одинаковый для всех вирусов одной группы – консервированный участок. Наличие Н-АГ определяют РГА, а тип Н-АГ определяют РТГА (реакция торможения агглюцинации).

 

Непрямые (пассивные) реакции агглютинации Для данной реакции растворимые антигены или антитела адсорбируют на корпускулярном носителе, которым служат инертные частицы (латекс, бентонит, активированный уголь и другие) или клетки, например, эритроциты (бараньи, О- группы человека).Пассивные реакции агглютинации по чувствительности намного превосходят прямую реакцию агглютинации.Если адсорбентом являются эритроциты, реакция носит название пассивной (непрямой) гемагглютинации – РПГА или (РНГА).    Реакцию обычно проводят с использованием пластмассовых пластин с лунками. Нагруженные (сенсибилизированные) эритроциты склеиваются в присутствии специфического искомого антигена или антитела и выпадают в осадок в виде гемагглютината в форме «зонтика». При отрицательной реакции сенсибилизированные эритроциты выпадают в осадок в виде «пуговки». При работе с растворимыми, мелкодисперсными антигенами применяют реакцию непрямой, или пассивной, гем-агглютинации (РПГА). Антиген предварительно адсорбируют на инертных монодисперсных частицах или клетках, например на эритроцитах, готовят эритроцитарный диагностикум. Такие нагруженные антигеном эритроциты склеиваются под действием иммунной сыворотки, содержащей антитела к данному антигену (РПГА).            Реакция отличается высокой чувствительностью и позволяет выявлять сравнительно небольшие концентрации антител в исследуемых сыворотках. При необходимости обнаружения антигена в исследуемом материале эритроциты предварительно нагружают специфическими антителами и также ставят РПГА. При помощи РПГА определяют полные (бивалентные) антитела. Неполные (моновалентные, блокирующие) антитела не выявляются этим методом, так как, соединяясь с антигеном, блокируют его, но не могут вызвать агрегации частиц в крупные конгломераты.

 

Реакция гемадсорбции — способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. «Цветная» реакция оценивается по изменению цвета индикатора, находящегося в питательной среде культивирования.Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе своего метаболизма выделяют кислые продукты, что ведет к изменению рН среды и соответственно цвета индикатора. При продукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет свой первоначальный цвет.

 

Реакция торможения гемадсорбции (РТГадс). Принцип реакции базируется на явлении гемадсорбции. Оно заключается в том, что эритроциты приобретают способность адсорбироваться на поверхности культур клеток, которые испытали модификацию в результате появления в оболочке гликопротеинов вирусов. Антитела иммунной сыворотки при взаимодействии с поверхностными антигенами вирусов, представленными в оболочке, связывают их, вследствии чего тормозится адсорбция эритроцитов на клетках.

           Компонентами реакции являются вирусы, способные к гемадсорбции, культура клеток, в которой они развиваются, противовирусная сыворотка с разведением 1:10 и больше, 0,4‑1,0 % завись эритроцитов петуха, гвинейской свинки или человека, трижды отмытая физраствором или раствором Хенкса. Специфические сыворотки, которые используют в опыте, предварительно обрабатывают ферментами, которые разрушают рецепторы, поддают температурному влиянию, чтобы освободить от неспецифических ингибиторов гемагглютинации. Реакцию ставят в пробирках или на специальных стеклянных пластинах, на которых есть монослой культуры клеток. Одно из преимуществ РТГадс заключается в том, что ее можно ставить к появлению цитопатического эффекта.

 

Практическая значимость использования реакций с метками (РИФ, ИФА, РИА и др.). Ингредиенты. Варианты постановки.

РИФ. Один из компонентов иммунной реакции, как правило АТ, метится (конъюгируется) флюоресцирующим красителем. Чаще всего для этого используют флюоресцеинизотиоционаты (ФИТЦ) – зеленое свечение в ультрафиолетовом свете и тетраметилродаминизотионат (ТРИТЦ) – оранжево -красное свечение. АТ, которые метят флюорохромом, должны обладать физико -химической гомогенностью. Наиболее подходящими для мечения являются моноклональные антитела. АГ (искомым или известным) для РИФ могут быть антигены, локализованные в клетке или на клетке, срезах тканей.

           РИФ выявляют и идентифицируют:

4. микроорганизмы в чистых и смешанных культурах, в мазках — отпечатка .

5. клетки, пораженные вирусами и другими микроорганизмами .

6. Т и В лимфоциты, нормальные киллеры и другие клетки иммунной системы.

РИФ используют:

4. для изучения биосинтеза иммуноглобулинов в плазмоцитах, их транспорта из клеток, иммуноглобулиновых рецепторов В лимфоцитов

5. для выявления титра антител при серодиагностике

6. для выяснения закономерностей возникновения и развития злокачественных новообразо- ваний на клеточном и тканевом уровне и т.д.

 

Варианты постановки РИФ:

3. Прямая РИФ. Для каждого изучаемого АГ должна быть гомологичная иммунофлюоресцентная сыворотка

4. Непрямая РИФ (РНИФ) основана на использовании двух различных антисывороток. Вначале применяют немеченые АТ к искомому АГ (или искомые АТ в сыворотке человека к известному АГ). На 2-м этапе образовавшийся комплекс АГ-АТ обрабатывают антилюминесцентной сывороткой, содержащей меченые флюорохромом АТ к иммуноглобулинам того вида животных, чья сыворотка использовалась на 1 этапе реакции

5. Антикомплементарный метод РИФ (РИФСК) основан на способности комплемента (сыворотки морских свинок) фиксироваться на иммунном комплексе. В этом варианте используют люминесцентные сыворотки против глобулинов (комплемента) морской свинки

Представленная информация была полезной?
ДА
58.73%
НЕТ
41.27%
Проголосовало: 962

6. РГИФ (реакция гашения иммунофлюоресценции). Используется для выявления титра АТ в исследуемой сы- воротке, при наличии известного клеточного АГ и специфической к нему люминесцентной сыворотки. На первом этапе на известный АГ наносят исследуемую сыворотку, и если в ней есть соответствующие антигену антитела, они занимают эпитопы АГ. При добавлении на втором этапе люминесцентной сыворотки к данным АГ, присоединение люминесцентных АТ к эпитопам происходить не будет. Свечения не наблюдается.

 

ИФА. Особенностью метода ИФА является использование функционально активной биологической молекулы фермента. Комплекс конъюгированных иммунореагентов с ферментами (ф) проявляет функциональную активность, т. е. сохраняется высокая специфичность иммунореагентов и способность фермента расщеплять добавленный субстрат (с) с образованием легко обнаруживаемых продуктов. В связи с этим можно регистрировать и учитывать количественно взаимодействие иммунореагента, например АТ с гомологичным АГ. Вначале ИФА использовали в иммуногистохимии для выявления локализации тканевых и клеточных АГ, а затем были разработаны варианты реакции, которыми можно качестdенно и количественно выявить иммунореагенты в жидкостях.    

Реагенты реакции:

5. Ферменты применяют только те, которые расщепляют субстрат с образованием продуктов легко (улавливаемых) определяемых: ПХ (пероксидаза хрена), ЩФ (щелочная фосфатаза), каталаза, уреаза, фосфолипаза и др. Ферменты, используемые в ИФА должны отвечать следующим требованиям: содержать в структуре определенные реакционные группы, по которым идет связывание с молекулой иммунореагента не меняя его специфичности . быть чистыми . сохранять ферментативную активность в конъюгированном с иммунореагентом виде. Субстрарами в зависимости от реагента используют: 5- аминосалициловую кислоту, ортофенилендиамин, пирогаллол и другие

6. Иммунореагенты. В настоящее время иммунореагентами, с которыми связыdают ферменты, могут быть АТ, АГ. Фермент присоединяют к иммунореагенту с помощью бифункциональных реагентов: глутарового альдегида, периодат натрия, фенилендималеимида и др. Эти соединения обладают химически активными группировками, которыми они ковалентно взаимодействуют с биомолекулами. Так, глутаровый альдегид реагирует преимущественно с E аминогруппами аминокислот, в частности лизина, периодат натрия с углеводными остатками.

 

Классификация и варианты ИФА Существует множество вариантов ИФА. Прежде всего ИФА включает две группы способов постановки реакции: твердофазный (гетерогенный) – ТИФА и гомогенный — ГИФА. Они в свою очередь подразделяются на различные модификации.

 

Гетерогенный (твердофазный) способ — твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА). При этом способе АГ или АТ предварительно адсорбируют на твердый носитель (сорбционно и ковалентно). В качестве твердой фазы используют различные микропористые (сефароза, стекло, биогель) и непористые носители (полистирол, полихлорвинил, нейлон, полистирен и другие). По физическому состоянию это могут быть гели, шарики, диски, титрационные панели.

 

Варианты ТИФА  Существуют неконкурентные и конкурентные варианты. При неконкурентных вариантах реакция АГ -АТ происходит на поверхности твердой фазы, ингредиенты добавляются последовательно и определяется количество метки, связавшейся с носителем. При этом количество связавшейся метки прямо пропорционально количеству искомого АТ или АГ в исследуемом образце. При конкурентных вариантах постановки реакции немеченый исследуемый образец и известное количество меченого искомого вносят в лунки, сенсибилизируют АГ или АТ одновременно, где происходит конкуренция между первым и вторым образцами за связывание с твердофазным иммуносорбентом. В этом случае    количество связанной с твердой фазой метки обратно пропорционально количеству    искомого образца. 

Конкурентные методы. На первом этапе к ТФ прикрепляется АТ против искомого АГ. Затем вносят испытуемую пробу и известное количество АГ, меченого ферментом, который конкурирует за центры связывания антител (важ-ным является правильный подбор концентрации меченого АГ). Или на первом этапе к ТФ прикрепляется АГ к искомым АТ (например, в сыворотке больного). Затем вносят исследуемую сыворотку (АТ? к АГ) и известное количество коъюгирующей с ферментом иммунной сыворотки, т.е. сыворотку с АТхФ к данному АГ. Эти сыворотки конкурируют за связывание с эпитопами антигена.

 

ПРИМЕНЕНИЕ ИФА. Методы ИФА широко используются в различных областях биологии и медицины. РИА это методики, в которых наличие ИК определяется с помощью радиоактивной метки, предварительно введенной в состав антител или антигенов. Наиболее широко используют две разновидности РИА: радиоиммунопреципитация (РИП) и твердофазный радиоиммунологический анализ (ТФ РИА).

Методика РИП заключается в:

5. формировании в растворе радиоактивного иммунного комплекса (при предварительном введении в состав одного из участников реакции антиген -антитело радиоактивной метки),

6. отделении этого комплекса от не вошедших в него макромолекул

7. анализе его радиоактивного компонента.

 

Отделение ИК от макромолекул проводится с помощью различных физико -химических методик: электрофореза в геле, агарозе, адсорбцией на различных органических и неорганических поверхностях и т.д., но наиболее часто для отделения ИК используется метод «двойных антител», в котором комплекс антиген -антитело утяжеляется с помощью его взаимодействия с антивидовыми иммуноглобулинами, специфичными к антителам, вошедшим в ИК. После формирования вторичного ИК высокомолекулярный преципитат отделяют фильтрацией или центрифугированием.Далее проводят количественный и качественный анализ радиоактивного компонента преципитата. РИП можно проводить либо в прямом, либо в конкурентном варианте. ТФ РИА заключается в формировании ИК не в растворе, а на твердой фазе, где предварительно иммобилизируют антиген или антитело. На иммобилизированный антиген (или антитело) последовательно сорбируются остальные компоненты ИК. Такая методика дает возможность удалять из смеси не вошедшие в ИК макромолекулы с помощью простой промывки. Наиболее простым вариантом ТФ РИА является прямой анализ, основанный на эффекте прямой адсорбции антигена на твердую фазу.

 


Поделиться статьей
Автор статьи
Анастасия
Анастасия
Задать вопрос
Эксперт
Представленная информация была полезной?
ДА
58.73%
НЕТ
41.27%
Проголосовало: 962

или напишите нам прямо сейчас:

Написать в WhatsApp Написать в Telegram

ОБРАЗЦЫ ВОПРОСОВ ДЛЯ ТУРНИРА ЧГК

Поделиться статьей

Поделиться статьей(Выдержка из Чемпионата Днепропетровской области по «Что? Где? Когда?» среди юношей (09.11.2008) Редакторы: Оксана Балазанова, Александр Чижов) [Указания ведущим:


Поделиться статьей

ЛИТЕЙНЫЕ ДЕФЕКТЫ

Поделиться статьей

Поделиться статьейЛитейные дефекты — понятие относительное. Строго говоря, де­фект отливки следует рассматривать лишь как отступление от заданных требований. Например, одни


Поделиться статьей

Введение. Псковская Судная грамота – крупнейший памятник феодального права эпохи феодальной раздробленности на Руси

Поделиться статьей

Поделиться статьей1. Псковская Судная грамота – крупнейший памятник феодального права эпохи феодальной раздробленности на Руси. Специфика периода феодальной раздробленности –


Поделиться статьей

Нравственные проблемы современной биологии

Поделиться статьей

Поделиться статьейЭтические проблемы современной науки являются чрезвычайно актуальными и значимыми. В связи с экспоненциальным ростом той силы, которая попадает в


Поделиться статьей

Семейство Первоцветные — Primulaceae

Поделиться статьей

Поделиться статьейВключает 30 родов, около 1000 видов. Распространение: горные и умеренные области Северного полушария . многие виды произрастают в горах


Поделиться статьей

Вопрос 1. Понятие цены, функции и виды. Порядок ценообразования

Поделиться статьей

Поделиться статьейЦенообразование является важнейшим рычагом экономического управления. Цена как экономическая категория отражает общественно необходимые затраты на производство и реализацию туристского


Поделиться статьей

или напишите нам прямо сейчас:

Написать в WhatsApp Написать в Telegram
Заявка
на расчет