АГ вирусов. По структуре они тримеры (из 3 мономеров), каждый мономер состоит из 2 цепей: легкой и тяжелой. Одним участком легкая часть погружена в липидный суперкапсид, а другой участок дисульфидными связями соединена с тяжелым участком. Наружный участок тяжелой цепи – эпитоп (специфичность) и этим же участком прикрепляет вирус к сиаловым рецепторам дыхательных путей.У легкой части есть участок, обеспечивающий слияние суперкапсида с мембраной клетки.У легкой цепи есть участок одинаковый для всех вирусов одной группы – консервированный участок. Наличие Н-АГ определяют РГА, а тип Н-АГ определяют РТГА (реакция торможения агглюцинации).
Непрямые (пассивные) реакции агглютинации Для данной реакции растворимые антигены или антитела адсорбируют на корпускулярном носителе, которым служат инертные частицы (латекс, бентонит, активированный уголь и другие) или клетки, например, эритроциты (бараньи, О- группы человека).Пассивные реакции агглютинации по чувствительности намного превосходят прямую реакцию агглютинации.Если адсорбентом являются эритроциты, реакция носит название пассивной (непрямой) гемагглютинации – РПГА или (РНГА). Реакцию обычно проводят с использованием пластмассовых пластин с лунками. Нагруженные (сенсибилизированные) эритроциты склеиваются в присутствии специфического искомого антигена или антитела и выпадают в осадок в виде гемагглютината в форме «зонтика». При отрицательной реакции сенсибилизированные эритроциты выпадают в осадок в виде «пуговки». При работе с растворимыми, мелкодисперсными антигенами применяют реакцию непрямой, или пассивной, гем-агглютинации (РПГА). Антиген предварительно адсорбируют на инертных монодисперсных частицах или клетках, например на эритроцитах, готовят эритроцитарный диагностикум. Такие нагруженные антигеном эритроциты склеиваются под действием иммунной сыворотки, содержащей антитела к данному антигену (РПГА). Реакция отличается высокой чувствительностью и позволяет выявлять сравнительно небольшие концентрации антител в исследуемых сыворотках. При необходимости обнаружения антигена в исследуемом материале эритроциты предварительно нагружают специфическими антителами и также ставят РПГА. При помощи РПГА определяют полные (бивалентные) антитела. Неполные (моновалентные, блокирующие) антитела не выявляются этим методом, так как, соединяясь с антигеном, блокируют его, но не могут вызвать агрегации частиц в крупные конгломераты.
Реакция гемадсорбции — способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. «Цветная» реакция оценивается по изменению цвета индикатора, находящегося в питательной среде культивирования.Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе своего метаболизма выделяют кислые продукты, что ведет к изменению рН среды и соответственно цвета индикатора. При продукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет свой первоначальный цвет.
Реакция торможения гемадсорбции (РТГадс). Принцип реакции базируется на явлении гемадсорбции. Оно заключается в том, что эритроциты приобретают способность адсорбироваться на поверхности культур клеток, которые испытали модификацию в результате появления в оболочке гликопротеинов вирусов. Антитела иммунной сыворотки при взаимодействии с поверхностными антигенами вирусов, представленными в оболочке, связывают их, вследствии чего тормозится адсорбция эритроцитов на клетках.
Компонентами реакции являются вирусы, способные к гемадсорбции, культура клеток, в которой они развиваются, противовирусная сыворотка с разведением 1:10 и больше, 0,4‑1,0 % завись эритроцитов петуха, гвинейской свинки или человека, трижды отмытая физраствором или раствором Хенкса. Специфические сыворотки, которые используют в опыте, предварительно обрабатывают ферментами, которые разрушают рецепторы, поддают температурному влиянию, чтобы освободить от неспецифических ингибиторов гемагглютинации. Реакцию ставят в пробирках или на специальных стеклянных пластинах, на которых есть монослой культуры клеток. Одно из преимуществ РТГадс заключается в том, что ее можно ставить к появлению цитопатического эффекта.
Практическая значимость использования реакций с метками (РИФ, ИФА, РИА и др.). Ингредиенты. Варианты постановки.
РИФ. Один из компонентов иммунной реакции, как правило АТ, метится (конъюгируется) флюоресцирующим красителем. Чаще всего для этого используют флюоресцеинизотиоционаты (ФИТЦ) – зеленое свечение в ультрафиолетовом свете и тетраметилродаминизотионат (ТРИТЦ) – оранжево -красное свечение. АТ, которые метят флюорохромом, должны обладать физико -химической гомогенностью. Наиболее подходящими для мечения являются моноклональные антитела. АГ (искомым или известным) для РИФ могут быть антигены, локализованные в клетке или на клетке, срезах тканей.
РИФ выявляют и идентифицируют:
4. микроорганизмы в чистых и смешанных культурах, в мазках — отпечатка .
5. клетки, пораженные вирусами и другими микроорганизмами .
6. Т и В лимфоциты, нормальные киллеры и другие клетки иммунной системы.
РИФ используют:
4. для изучения биосинтеза иммуноглобулинов в плазмоцитах, их транспорта из клеток, иммуноглобулиновых рецепторов В лимфоцитов
5. для выявления титра антител при серодиагностике
6. для выяснения закономерностей возникновения и развития злокачественных новообразо- ваний на клеточном и тканевом уровне и т.д.
Варианты постановки РИФ:
3. Прямая РИФ. Для каждого изучаемого АГ должна быть гомологичная иммунофлюоресцентная сыворотка
4. Непрямая РИФ (РНИФ) основана на использовании двух различных антисывороток. Вначале применяют немеченые АТ к искомому АГ (или искомые АТ в сыворотке человека к известному АГ). На 2-м этапе образовавшийся комплекс АГ-АТ обрабатывают антилюминесцентной сывороткой, содержащей меченые флюорохромом АТ к иммуноглобулинам того вида животных, чья сыворотка использовалась на 1 этапе реакции
5. Антикомплементарный метод РИФ (РИФСК) основан на способности комплемента (сыворотки морских свинок) фиксироваться на иммунном комплексе. В этом варианте используют люминесцентные сыворотки против глобулинов (комплемента) морской свинки
6. РГИФ (реакция гашения иммунофлюоресценции). Используется для выявления титра АТ в исследуемой сы- воротке, при наличии известного клеточного АГ и специфической к нему люминесцентной сыворотки. На первом этапе на известный АГ наносят исследуемую сыворотку, и если в ней есть соответствующие антигену антитела, они занимают эпитопы АГ. При добавлении на втором этапе люминесцентной сыворотки к данным АГ, присоединение люминесцентных АТ к эпитопам происходить не будет. Свечения не наблюдается.
ИФА. Особенностью метода ИФА является использование функционально активной биологической молекулы фермента. Комплекс конъюгированных иммунореагентов с ферментами (ф) проявляет функциональную активность, т. е. сохраняется высокая специфичность иммунореагентов и способность фермента расщеплять добавленный субстрат (с) с образованием легко обнаруживаемых продуктов. В связи с этим можно регистрировать и учитывать количественно взаимодействие иммунореагента, например АТ с гомологичным АГ. Вначале ИФА использовали в иммуногистохимии для выявления локализации тканевых и клеточных АГ, а затем были разработаны варианты реакции, которыми можно качестdенно и количественно выявить иммунореагенты в жидкостях.
Реагенты реакции:
5. Ферменты применяют только те, которые расщепляют субстрат с образованием продуктов легко (улавливаемых) определяемых: ПХ (пероксидаза хрена), ЩФ (щелочная фосфатаза), каталаза, уреаза, фосфолипаза и др. Ферменты, используемые в ИФА должны отвечать следующим требованиям: содержать в структуре определенные реакционные группы, по которым идет связывание с молекулой иммунореагента не меняя его специфичности . быть чистыми . сохранять ферментативную активность в конъюгированном с иммунореагентом виде. Субстрарами в зависимости от реагента используют: 5- аминосалициловую кислоту, ортофенилендиамин, пирогаллол и другие
6. Иммунореагенты. В настоящее время иммунореагентами, с которыми связыdают ферменты, могут быть АТ, АГ. Фермент присоединяют к иммунореагенту с помощью бифункциональных реагентов: глутарового альдегида, периодат натрия, фенилендималеимида и др. Эти соединения обладают химически активными группировками, которыми они ковалентно взаимодействуют с биомолекулами. Так, глутаровый альдегид реагирует преимущественно с E аминогруппами аминокислот, в частности лизина, периодат натрия с углеводными остатками.
Классификация и варианты ИФА Существует множество вариантов ИФА. Прежде всего ИФА включает две группы способов постановки реакции: твердофазный (гетерогенный) – ТИФА и гомогенный — ГИФА. Они в свою очередь подразделяются на различные модификации.
Гетерогенный (твердофазный) способ — твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА). При этом способе АГ или АТ предварительно адсорбируют на твердый носитель (сорбционно и ковалентно). В качестве твердой фазы используют различные микропористые (сефароза, стекло, биогель) и непористые носители (полистирол, полихлорвинил, нейлон, полистирен и другие). По физическому состоянию это могут быть гели, шарики, диски, титрационные панели.
Варианты ТИФА Существуют неконкурентные и конкурентные варианты. При неконкурентных вариантах реакция АГ -АТ происходит на поверхности твердой фазы, ингредиенты добавляются последовательно и определяется количество метки, связавшейся с носителем. При этом количество связавшейся метки прямо пропорционально количеству искомого АТ или АГ в исследуемом образце. При конкурентных вариантах постановки реакции немеченый исследуемый образец и известное количество меченого искомого вносят в лунки, сенсибилизируют АГ или АТ одновременно, где происходит конкуренция между первым и вторым образцами за связывание с твердофазным иммуносорбентом. В этом случае количество связанной с твердой фазой метки обратно пропорционально количеству искомого образца.
Конкурентные методы. На первом этапе к ТФ прикрепляется АТ против искомого АГ. Затем вносят испытуемую пробу и известное количество АГ, меченого ферментом, который конкурирует за центры связывания антител (важ-ным является правильный подбор концентрации меченого АГ). Или на первом этапе к ТФ прикрепляется АГ к искомым АТ (например, в сыворотке больного). Затем вносят исследуемую сыворотку (АТ? к АГ) и известное количество коъюгирующей с ферментом иммунной сыворотки, т.е. сыворотку с АТхФ к данному АГ. Эти сыворотки конкурируют за связывание с эпитопами антигена.
ПРИМЕНЕНИЕ ИФА. Методы ИФА широко используются в различных областях биологии и медицины. РИА это методики, в которых наличие ИК определяется с помощью радиоактивной метки, предварительно введенной в состав антител или антигенов. Наиболее широко используют две разновидности РИА: радиоиммунопреципитация (РИП) и твердофазный радиоиммунологический анализ (ТФ РИА).
Методика РИП заключается в:
5. формировании в растворе радиоактивного иммунного комплекса (при предварительном введении в состав одного из участников реакции антиген -антитело радиоактивной метки),
6. отделении этого комплекса от не вошедших в него макромолекул
7. анализе его радиоактивного компонента.
Отделение ИК от макромолекул проводится с помощью различных физико -химических методик: электрофореза в геле, агарозе, адсорбцией на различных органических и неорганических поверхностях и т.д., но наиболее часто для отделения ИК используется метод «двойных антител», в котором комплекс антиген -антитело утяжеляется с помощью его взаимодействия с антивидовыми иммуноглобулинами, специфичными к антителам, вошедшим в ИК. После формирования вторичного ИК высокомолекулярный преципитат отделяют фильтрацией или центрифугированием.Далее проводят количественный и качественный анализ радиоактивного компонента преципитата. РИП можно проводить либо в прямом, либо в конкурентном варианте. ТФ РИА заключается в формировании ИК не в растворе, а на твердой фазе, где предварительно иммобилизируют антиген или антитело. На иммобилизированный антиген (или антитело) последовательно сорбируются остальные компоненты ИК. Такая методика дает возможность удалять из смеси не вошедшие в ИК макромолекулы с помощью простой промывки. Наиболее простым вариантом ТФ РИА является прямой анализ, основанный на эффекте прямой адсорбции антигена на твердую фазу.
